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                      16S rDNA分子生態測序分析服務

                      更新時間:2014-07-04 10:03:13點擊次數:10567次字號:T|T
                      Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) 16s rDNA測序是下一代測序基礎上微生物研究領域的應用。其對微生物16s rDNA測序,首先得到的原始圖像文件,然后經過堿基識別及誤差過濾,最終得到可以用于分析的原始測序片段,我們稱之為Reads,它包括序列的堿基組成信息以及其對應的序列質量信息。 可接收樣本類型:口腔唾液、腸道菌群、土壤、水體等。 一、 提供DNA樣品的基本要求: 1.樣品純度:OD 260/280值應...

                      Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) 16s rDNA測序是下一代測序基礎上微生物研究領域的應用。其對微生物16s rDNA測序,首先得到的原始圖像文件,然后經過堿基識別及誤差過濾,最終得到可以用于分析的原始測序片段,我們稱之為Reads,它包括序列的堿基組成信息以及其對應的序列質量信息。


                      可接收樣本類型:口腔唾液、腸道菌群、土壤、水體等。

                      一、 提供DNA樣品的基本要求:

                      1.樣品純度:OD 260/280值應在1.7~2.0 之間;RNA 應該去除干凈。

                      2.樣品濃度:最低濃度不低于20ng/?L。

                      3.樣品總量:每個樣品總量不少于0.5?g。

                      4.樣品溶劑:要溶解在H20或TE(pH 8.0)中。

                      5.樣品運輸:DNA低溫運輸(-20℃),且在運輸過程中請用parafilm將管口密封好,以防出現污染;收到樣品后,公司對樣品進行檢測,最終樣品的量和純度,以公司的檢測結果為準。


                      二、數據分析:

                      測序序列質量評估

                      應用測序質量Q值進行評估,Q值與測序錯誤E值之間關系為:


                      評估方法

                      Q值盒圖統計:

                      盒圖即是質量分位圖,黃色長方形最下面的邊為占25%比例的,質量Q值,依此往上分別為占50%比例,占75%比例對應的質量Q值,上下的黑線代表占90%和10%對應的質量值,藍色的線表示質量數值的平均值、綠色背景部分代表高質量數值部分、橘色背景部分代表合理質量數值部分、紅色背景部分代表低質量數值部分。


                      圖 quality statistics
                      橫坐標為reads的堿基位置,縱坐標為所有reads在每個位置上的
                      質量(Q: 0~40)分布。此為一個樣本雙端測序結果綜合示例。


                      數據預處理

                      本步驟將利用引物設計序列,以此來確認真實有效的16s rRNA 序列片段。這里我們選取兩頭皆為正確引物序列的reads 作為clean reads 進行分析。


                      各樣品物種分類

                      使用mothur(version: 1.31.2)工具的“classify.seqs()”方法對每個樣品進行物種分類鑒定,去除Mitochondria,Chloroplast,Eukaryota,和unknown(未在數據庫中檢索到)的結果。隨機取樣bootstrap 閾值設置為80%。

                      使用的數據庫是RDP training set (v9),下載地址為:http://www.mothur.org/w/images/5/59/Trainset9_032012.pds.zip

                      選取某一分類層次上物種分類繪圖。這里選取分類為第二層:圖中顯示的比例指該物種分類在各樣本中的序列數目占該物種分類所有序列數目的百分比。



                      各樣品OTU及豐度和分類

                      使用“mothur”工具通過與GreenGene數據庫比對,生成OTU,并計算各個OTU在每個樣品中的豐度及物種分類,去除Mitochondria,Chloroplast,Eukaryota,和unknown(未在數據庫中檢索到)的結果。


                      樣品豐富度稀疏曲線

                      接下來使用sobs 算法對各樣本進行隨機抽樣并計算OTU 的數目豐富度。據此,最終繪制豐富度(richness)稀疏曲線。橫坐標為抽樣序列數目, 縱坐標為抽樣序列中的OTU 的數目。

                      相似性水平為0.03 的各樣本OTU 數目的稀疏曲線


                      香農指數

                      計算各樣本香農(shannon)指數。繪制多樣性(alpha-diversity)曲線橫坐標為抽樣序列數目,縱坐 標為對應的香農指數。


                      Rank-Abundance 曲線

                      根據各樣品的OTU 豐度和排序做Rank-Abundance 曲線。


                      組間韋恩圖

                      根據以上OTU 在各樣本中的分類信息繪制韋恩(venn diagram)圖。交叉的部分指相鄰樣品共同的OTU。


                      群落相似度分析

                      根據各樣品OTU 組成和豐度的差異,計算樣品間的相似度,繪制相似度樹。



                      (編輯:sgfmt)

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